Brotherhood tem tanto casca e picada. Se você jogou Assassins Creed II, então você já sabe Caterina Sforza, a condessa italiana graciosa com um fraquinho por assassinos manhoso, robustos. Ela não é a única personagem feminina com um papel importante a desempenhar na Irmandade, no entanto. Claudia Auditore não é mais apenas um guarda-livros submisso, mas sim uma jovem mulher forte que acaba aprendendo a lidar com uma lâmina. E depois há a irmã de Cesare Borgia astúcia Lucrezia, cuja língua afiada é compensada pela sua aparência severa, quase vampírico.